В. В. Белов, Е. Л. Мальцева, Н. П. Пальмина

Цель данной работы заключалась в изучении методом спинового зонда действия природного анти-оксиданта a-токоферола ( a-тф) от концентраций 10^-3 моль/л до разведений 10^-25 моль/л in vitro на структурные характеристики (микровязкость, параметр упорядоченности) мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей. В качестве спиновых зондов использованы стабильные нитроксильные радикалы - 16-доксилстеариновая кислота (с глубиной локализации ~20А) и 5-доксилстеариновая кислота (с глубиной локализации ~5А). Показано, что при определенных концентрациях a-тф вызывает увеличение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя и жесткости поверхностных. Полученные концентрационные зависимости имеют полимодальный профиль, характерный для действия веществ в сверхмалых дозах. Кроме того, в глубоколежащих областях липидного бислоя микросомальных мембран обнаружены увеличение количества и появление более высококооперативных термоиндуцированных структурных переходов, а также увеличение их эффективной энергии активации с ростом температуры при добавлении различных доз a-тф.

В настоящее время проблема действия биологически активных веществ (БАВ) в сверхмалых дозах (СМД) весьма актуальна. Несмотря на то что эффекты обнаружены на различных уровнях организации живых систем, начиная от популяций и заканчивая отдельными рецепторами, проблема далека от своего решения. Вместе с тем природа общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишеней, например клеточных и внутриклеточных мембран. В ряде исследований было обнаружено, что при введении СМД БАВ (регуляторных пептидов, природных антиоксидантов, форболовых эфиров) в организм животного, клеточную культуру или в модельную систему, содержащую суспензию мембран, отмечается изменение структурных характеристик липидного бислоя мембран [1-4]. Между тем физико-химическое состояние липидного бислоя является важнейшим параметром регуляторной системы пероксидного окисления липидов (ПОЛ), нарушения в функционировании которой оказывают значительное влияние на активность мембрано-связанных ферментов и приводят к изменению функционального состояния клетки. В связи с тем, что уже получены данные о влиянии a-токоферола (a-тф) в широком спектре концентраций (10^-18-10^-4 моль/л), включая область СМД, на спонтанное и инициированное ПОЛ [5], представляло интерес изучить действие a-тф in vitro на структурное состояние липидного бислоя мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей в широком диапазоне: от концентраций 10^-3 до разведений 10^-25 моль/л.

Материалы и методика

Растворы a-тф были получены методом последовательного разведения через один порядок его исходного 10 моль/л раствора спиртом высокой очистки фирмы "Merck" (Германия) до концентрации 10^-3 моль/л, а затем дистиллированной водой.

Мембраны эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей линии F₁(C₅₇xDBA₂) выделялись последовательным центрифугированием по методу, описанному в работе [6]. Мышей забивали методом декапитации. Определение концентрации белка проводили по методу Лоури [7].

Параметры, характеризующие структурное состояние мембран, рассчитывали из спектров, полученных на ЭПР-спектрометре "Bruker-200D" (ФРГ) методом спинового зонда [8], в качестве которого для изучения жесткости поверхностных областей (~8А) липидного бислоя применялся стабильный нитроксильный радикал 5-доксилстеариновая кислота (С₅), а для изучения микровязкости, термоиндуцированных структурных переходов и их эффективной энергии активации в глубоколежащих областях (~20А) липидного бислоя - 16-доксилстеариновая кислота (С₁₆). Жесткость мембраны в области локализации зонда С₅ характеризовалась параметром DH_П (расстоянием между низкопольным и высокопольным компонентами спектра), величиной, пропорциональной параметру упорядоченности S, характеризующему подвижность жирнокислотных цепей липидов в области локализации радикала. Микровязкость мембраны в области локализации зонда С₅ характеризовалась временами его вращательной корреляции t_с1 и t_с2, которые определялись по формулам для быстрого анизотропного вращения радикалов [8]. Термостатирование образца обеспечивалось термоприставкой фирмы "Bruker" с точностью термостатирования ±0.05°С. Измерения проводились в диапазоне температур от 285 до 320 К с интервалом 2 К.

При статистической обработке данных надежность принималась равной 95%. Для определения достоверности отличия опыта по сравнению с контролем применялся Mest.

Результаты и обсуждение

В результате изучения влияния a-тф на микровязкость глубоколежащих областей липидного бислоя мембран при температуре 293К были получены характерные для действия веществ в СМД полимодальные концентрационные зависимости эффектов, выраженных в процентах по отношению к контролю, которые представлены на рис. 1, а. Важно отметить, что все концентрации a-тф (кроме 10^-22 моль/л) вызывают увеличение параметров t_с1 и t_с2, т.е. микровязкости в области локализации зонда С₁₆, причем величины эффектов при действии СМД a-тф сопоставимы с изменениями, вызванными действием его "физиологических" концентраций (10^-9 - 10^-6 моль/л).

Рис. 1. Концентрационная зависимость действия a-тф in vitro на микровязкость (а) глубоколежащих (t_с2) и жесткость (б) поверхностных (DH_П) областей липидного бислоя микросомальных мембран при температуре 293К. Концентрация белка в мембранной суспензии 4 мг/мл.

Изучение температурных зависимостей t_с1 и t_с2 для контроля и концентраций a-тф 5х10^-5, 10^-6,10^-7, 10^-10, 10^-14, 10^-15, 10^-18, 10^-20, 10^-22 и 10^-24 моль/л позволило выявить изменения количества и качества термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое и их эффективной энергии активации под действием a-тф (таблица).

Эффективная энергия активации (кДж/моль/л) термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях (~20 А) липидного бислоя микросомальных мембран клеток печени мышей в контроле и при действии a-токоферола in vitro в различных концентрациях.

Структурные переходы характеризуются точками излома между линеаризованными участками температурных зависимостей, представленных в аррениусовых координатах -lgt_с от 1/Т, а эффективная энергия активации переходов определялась из тангенса угла наклона каждого линеаризованного участка графика, как показано на рис. 2.

Рис. 2. Характерная температурная зависимость t_с1 зонда С₁₆ в Аррениусовых координатах на примере действия контрольной пробы.

В контроле и при действии a-тф в концентрациях 5х10^-5 и 10^-18 моль/л наблюдается минимальное количество переходов - два. Максимальное число переходов (четыре) отмечено при действии доз 10^-6 и 10^-15 моль/л , при которых имели место максимумы на дозовой зависимости действия a-тф при температуре 293К. Также наблюдаются изменения в положении и ширине переходов по сравнению с контролем. При всех изученных концентрациях a-тф, кроме 10^-6 и 10^-24 моль/л , в том числе и в СМД, наблюдается уменьшение количества широких переходов и преобладание узких, что говорит об увеличении кооперативности переходов по сравнению с контролем. Вместе с кооперативностью происходит увеличение и эффективной энергии активации переходов, поскольку эти величины взаимозависимые. Ко всему прочему, в целом наблюдается рост ее величины с ростом температуры.

Изучались также и изменения в жесткости (DH_П) поверхностных областей (~8А) липидного бислоя микросомальных мембран под действием a-тф в диапазоне концентраций 10^-18-10^-3 моль/л при температуре 293К. На рис. 1, б представлена полученная концентрационная зависимость эффектов a-тф, имеющая бимодальный вид, характерный для действия веществ в СМД, с максимумами в дозах 10^-13 и 10^-5 моль/л , между которыми лежит широкая "мертвая зона", охватывающая пять порядков по концентрации. Действие a-тф во всех концентрациях, кроме 5х10^-4 моль/л , вызывает увеличение параметра DH_П, что говорит об увеличении жесткости мембраны. При этом эффект в области СМД в 2 раза выше, чем в области обычных "физиологических" концентраций a-тф. Таким образом, достоверно показано, что действие a-тф в широком диапазоне разведений, включающем СМД, вызывает структурные изменения как в поверхностных, так и в глубоколежащих областях липидного бислоя, которые при определенных концентрациях a-тф приводят к повышению жесткости липидов микросомальных мембран. Все описанные выше изменения позволяют сделать предположение о концентрационнозависимом стабилизирующем эффекте действия a-тф на структуру липидного бислоя мембраны.

Список литературы

1. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева ЕЛ., Пынзаръ ЕМ. // Биол. мембраны. 1992. Т. 9. № 8. С. 810-820.
2. Конюхов А.Н., Пынзарь Е.И., Прайм Я.И., Пальмина Н.П. // Тез. IX конф. "Магнитный резонанс в химии и биологии". Звенигород, 1996. С. 30.
3. Гендель Л.Я., Яковлева Н.Е., Лелекова Т.В. и др. //Изв. РАН. Сер. биол. 1997. № 1. С. 103-106.
4. Белов В.В., Muschalle Т., Мальцева ЕЛ., Пальмина Н.П. // Тез. VI Междунар. конф. "Биоантиокси- дант". М., 2002. С. 658-659.
5. Палъмина Н.П., Кледова Л.В., Панкова Т.В. // Тез.III Междунар. симп. "Механизмы действия сверх малых доз". М., 2002. С. 27.
6. Hostetler K.Y., Zenner D.B., Morris H.P. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 441. P. 231-238.
7. Lowry O., Rosenbrouch N., BarrA., Randall R. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
8. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976. 210 с.