Вверх
на главную страницу

История
или как это начиналось

Факты
или что про это знают

Идеи
или что про это думают

Люди
или кто над этим работает

Библиография
или что об этом пишут

Конференции
или где это обсуждают

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ,
2003, том 43, № 3, с. 306-309

Материалы III Международного Симпозиума

В. В. Белов, Е. Л. Мальцева, Н. П. Пальмина

Влияние a-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей in vitro

Цель данной работы заключалась в изучении методом спинового зонда действия природного анти-оксиданта a-токоферола ( a-тф) от концентраций 10-3 моль/л до разведений 10-25 моль/л in vitro на структурные характеристики (микровязкость, параметр упорядоченности) мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей. В качестве спиновых зондов использованы стабильные нитроксильные радикалы - 16-доксилстеариновая кислота (с глубиной локализации ~20А) и 5-доксилстеариновая кислота (с глубиной локализации ~5А). Показано, что при определенных концентрациях a-тф вызывает увеличение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя и жесткости поверхностных. Полученные концентрационные зависимости имеют полимодальный профиль, характерный для действия веществ в сверхмалых дозах. Кроме того, в глубоколежащих областях липидного бислоя микросомальных мембран обнаружены увеличение количества и появление более высококооперативных термоиндуцированных структурных переходов, а также увеличение их эффективной энергии активации с ростом температуры при добавлении различных доз a-тф.

В настоящее время проблема действия биологически активных веществ (БАВ) в сверхмалых дозах (СМД) весьма актуальна. Несмотря на то что эффекты обнаружены на различных уровнях организации живых систем, начиная от популяций и заканчивая отдельными рецепторами, проблема далека от своего решения. Вместе с тем природа общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишеней, например клеточных и внутриклеточных мембран. В ряде исследований было обнаружено, что при введении СМД БАВ (регуляторных пептидов, природных антиоксидантов, форболовых эфиров) в организм животного, клеточную культуру или в модельную систему, содержащую суспензию мембран, отмечается изменение структурных характеристик липидного бислоя мембран [1-4]. Между тем физико-химическое состояние липидного бислоя является важнейшим параметром регуляторной системы пероксидного окисления липидов (ПОЛ), нарушения в функционировании которой оказывают значительное влияние на активность мембрано-связанных ферментов и приводят к изменению функционального состояния клетки. В связи с тем, что уже получены данные о влиянии a-токоферола (a-тф) в широком спектре концентраций (10-18-10-4 моль/л), включая область СМД, на спонтанное и инициированное ПОЛ [5], представляло интерес изучить действие a-тф in vitro на структурное состояние липидного бислоя мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей в широком диапазоне: от концентраций 10-3 до разведений 10-25 моль/л.

Материалы и методика

Растворы a-тф были получены методом последовательного разведения через один порядок его исходного 10 моль/л раствора спиртом высокой очистки фирмы "Merck" (Германия) до концентрации 10-3 моль/л, а затем дистиллированной водой.

Мембраны эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей линии F1(C57xDBA2) выделялись последовательным центрифугированием по методу, описанному в работе [6]. Мышей забивали методом декапитации. Определение концентрации белка проводили по методу Лоури [7].

Параметры, характеризующие структурное состояние мембран, рассчитывали из спектров, полученных на ЭПР-спектрометре "Bruker-200D" (ФРГ) методом спинового зонда [8], в качестве которого для изучения жесткости поверхностных областей (~8А) липидного бислоя применялся стабильный нитроксильный радикал 5-доксилстеариновая кислота (С5), а для изучения микровязкости, термоиндуцированных структурных переходов и их эффективной энергии активации в глубоколежащих областях (~20А) липидного бислоя - 16-доксилстеариновая кислота (С16). Жесткость мембраны в области локализации зонда С5 характеризовалась параметром DHП (расстоянием между низкопольным и высокопольным компонентами спектра), величиной, пропорциональной параметру упорядоченности S, характеризующему подвижность жирнокислотных цепей липидов в области локализации радикала. Микровязкость мембраны в области локализации зонда С5 характеризовалась временами его вращательной корреляции tс1 и tс2, которые определялись по формулам для быстрого анизотропного вращения радикалов [8]. Термостатирование образца обеспечивалось термоприставкой фирмы "Bruker" с точностью термостатирования ±0.05°С. Измерения проводились в диапазоне температур от 285 до 320 К с интервалом 2 К.

При статистической обработке данных надежность принималась равной 95%. Для определения достоверности отличия опыта по сравнению с контролем применялся Mest.

Результаты и обсуждение

В результате изучения влияния a-тф на микровязкость глубоколежащих областей липидного бислоя мембран при температуре 293К были получены характерные для действия веществ в СМД полимодальные концентрационные зависимости эффектов, выраженных в процентах по отношению к контролю, которые представлены на рис. 1, а. Важно отметить, что все концентрации a-тф (кроме 10-22 моль/л) вызывают увеличение параметров tс1 и tс2, т.е. микровязкости в области локализации зонда С16, причем величины эффектов при действии СМД a-тф сопоставимы с изменениями, вызванными действием его "физиологических" концентраций (10-9 - 10-6 моль/л).


Рис. 1. Концентрационная зависимость действия a-тф in vitro на микровязкость (а) глубоколежащих (tс2) и жесткость (б) поверхностных (DHП) областей липидного бислоя микросомальных мембран при температуре 293К. Концентрация белка в мембранной суспензии 4 мг/мл.

Изучение температурных зависимостей tс1 и tс2 для контроля и концентраций a-тф 5х10-5, 10-6,10-7, 10-10, 10-14, 10-15, 10-18, 10-20, 10-22 и 10-24 моль/л позволило выявить изменения количества и качества термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое и их эффективной энергии активации под действием a-тф (таблица).

Эффективная энергия активации (кДж/моль/л) термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях (~20 А) липидного бислоя микросомальных мембран клеток печени мышей в контроле и при действии a-токоферола in vitro в различных концентрациях.


Структурные переходы характеризуются точками излома между линеаризованными участками температурных зависимостей, представленных в аррениусовых координатах -lgtс от 1/Т, а эффективная энергия активации переходов определялась из тангенса угла наклона каждого линеаризованного участка графика, как показано на рис. 2.

Рис. 2. Характерная температурная зависимость tс1 зонда С16 в Аррениусовых координатах на примере действия контрольной пробы.

В контроле и при действии a-тф в концентрациях 5х10-5 и 10-18 моль/л наблюдается минимальное количество переходов - два. Максимальное число переходов (четыре) отмечено при действии доз 10-6 и 10-15 моль/л , при которых имели место максимумы на дозовой зависимости действия a-тф при температуре 293К. Также наблюдаются изменения в положении и ширине переходов по сравнению с контролем. При всех изученных концентрациях a-тф, кроме 10-6 и 10-24 моль/л , в том числе и в СМД, наблюдается уменьшение количества широких переходов и преобладание узких, что говорит об увеличении кооперативности переходов по сравнению с контролем. Вместе с кооперативностью происходит увеличение и эффективной энергии активации переходов, поскольку эти величины взаимозависимые. Ко всему прочему, в целом наблюдается рост ее величины с ростом температуры.

Изучались также и изменения в жесткости (DHП) поверхностных областей (~8А) липидного бислоя микросомальных мембран под действием a-тф в диапазоне концентраций 10-18-10-3 моль/л при температуре 293К. На рис. 1, б представлена полученная концентрационная зависимость эффектов a-тф, имеющая бимодальный вид, характерный для действия веществ в СМД, с максимумами в дозах 10-13 и 10-5 моль/л , между которыми лежит широкая "мертвая зона", охватывающая пять порядков по концентрации. Действие a-тф во всех концентрациях, кроме 5х10-4 моль/л , вызывает увеличение параметра DHП, что говорит об увеличении жесткости мембраны. При этом эффект в области СМД в 2 раза выше, чем в области обычных "физиологических" концентраций a-тф. Таким образом, достоверно показано, что действие a-тф в широком диапазоне разведений, включающем СМД, вызывает структурные изменения как в поверхностных, так и в глубоколежащих областях липидного бислоя, которые при определенных концентрациях a-тф приводят к повышению жесткости липидов микросомальных мембран. Все описанные выше изменения позволяют сделать предположение о концентрационнозависимом стабилизирующем эффекте действия a-тф на структуру липидного бислоя мембраны.

Список литературы

  1. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева ЕЛ., Пынзаръ ЕМ. // Биол. мембраны. 1992. Т. 9. № 8. С. 810-820.
  2. Конюхов А.Н., Пынзарь Е.И., Прайм Я.И., Пальмина Н.П. // Тез. IX конф. "Магнитный резонанс в химии и биологии". Звенигород, 1996. С. 30.
  3. Гендель Л.Я., Яковлева Н.Е., Лелекова Т.В. и др. //Изв. РАН. Сер. биол. 1997. № 1. С. 103-106.
  4. Белов В.В., Muschalle Т., Мальцева ЕЛ., Пальмина Н.П. // Тез. VI Междунар. конф. "Биоантиокси- дант". М., 2002. С. 658-659.
  5. Палъмина Н.П., Кледова Л.В., Панкова Т.В. // Тез.III Междунар. симп. "Механизмы действия сверх малых доз". М., 2002. С. 27.
  6. Hostetler K.Y., Zenner D.B., Morris H.P. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 441. P. 231-238.
  7. Lowry O., Rosenbrouch N., BarrA., Randall R. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
  8. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976. 210 с.
Hosted by uCoz